バイヤーズガイド PCR テクノロジー

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 技術は、生物医学、臨床診断、食品微生物検査、犯罪科学捜査などの幅広い分野で、無数の研究および検査ラボの定番となっています。この基本技術は、熱サイクルを使用して一連の反応を促進し、DNA サンプルが迅速かつ指数関数的に複製されて、数百万または数十億の配列コピーが生成されます。新しい PCR システムを購入する場合は、アプリケーションの最終目標、サーマル サイクル装置の精度と効率、装置の容量と柔軟性を考慮することが重要です。この記事では、アプリケーションに適したシステムを絞り込むのに役立つ、PCR システムで利用可能なさまざまなオプションと機能の概要を説明します。

1. PCR 対 qPCR 対 dPCR

すべての PCR システムはポリメラーゼ連鎖反応を使用して DNA を複製しますが、特定の結果を達成するためにシステムごとに異なる方法論が使用されます。これらの異なる方法の中には、標準 PCR、定量 PCR (qPCR)、およびデジタル PCR (dPCR) があります。

標準的な PCR 装置は、通常、後続の検査および使用のために DNA を増幅するために使用されます。ある意味、この技術は分析試験方法そのものとしてではなく、最終製品を生成する手段として使用されます。増幅された DNA は、リアルタイムではなく、PCR 反応が完了した後にのみ測定できるため、この方法はエンドポイント PCR と呼ばれることもあります。従来の PCR 増幅の最終産物は、下流のクローニングおよびシーケンスに一般的に使用され、ゲル電気泳動を使用してチェックして、ターゲット配列の存在とその相対量を低解像度 (バンド強度に基づく) で確認することもできます。

サンプル中に存在する標的配列の量をより迅速かつ正確に定量するために、リアルタイム PCR とも呼ばれる定量的 PCR (qPCR) では、増幅プロセス中に蛍光プローブを使用して、各熱サイクル後に存在する DNA の量をモニタリングします。蛍光強度の特定の閾値を満たすために必要なサイクル数を観察することにより、分析者は結果を標準曲線と比較するときに出発物質中の DNA の量を決定できます。また、qPCR は、エンドポイント PCR よりも迅速に標的配列の有無を確認できるため、SARS-CoV-2 の検出（最初にウイルス RNA を cDNA に変換する逆転写を使用）などの診断用途にも使用されます。

デジタル PCR (dPCR) は、PCR 反応が数千の別々の反応チャンバーで行われるもう 1 つの定量的方法であり、元のサンプル中の DNA 分子の絶対数は、増幅が完了した後に蛍光シグナルを生成する反応チャンバーの数に基づいて決定できます。 。qPCR とは異なり、蛍光測定はリアルタイムでは実行されず、サンプル中の DNA を定量するために標準曲線は必要ありません。dPCR は通常、qPCR よりもスループットが限られ、コストが高くなりますが、DNA の定量化においてはより正確、高感度、正確であり、まれな突然変異や一塩基多型 (SNP) の検出などの用途に特に役立ちます。

エンドポイント (定性/半定量) PCR と定量 (qPCR または dPCR) のどちらの方法を選択するかの決定は、アプリケーションを考慮すると比較的簡単ですが、qPCR と dPCR のどちらを選択するかはより微妙な場合があります。qPCR は、ハイスループット、コスト効率が高く、多くのアプリケーションにとって十分な感度を備えていますが、低い検出限界での絶対定量が最優先される場合は、dPCR の方が良い選択となる可能性があります。

2. 温度管理の重要性

サンプルの温度を正確かつ効率的に調整および制御するサーマルサイクラーの機能は、増幅反応の成功を可能にするものであり、PCR システムを選択する際の中心的な焦点となります。システムが異なれば、ランプレート、温度の均一性と精度、および PCR 法の最適化を支援するサーマルブロック全体で温度勾配を実現する機能に関して、異なる機能が提供される場合があります。

ランプレートとは、熱サイクルステップ間の温度変化の速度を指し、機器の仕様では通常、1 秒あたりの摂氏度 (°C/秒) として表されます。メーカーは、機器の上昇上昇率 (加熱) と下降上昇率 (冷却) を区別するだけでなく、最大上昇率と平均上昇率に関する情報を提供する場合があります。一般に、ランプレートが高いほど実行時間は速くなりますが、購入者は機器の速度に関連する他の指標を検討せずに最大ランプレートに焦点を当てることに注意する必要があります。機器は短時間しか最大上昇速度に達しない可能性があり、平均上昇速度は温度変化のペースをよりよく反映します。ランプレートの仕様から、特定の機器がどれくらいの速度で実行できるかについての一般的なアイデアが得られる場合がありますが、可能であれば、機器で実証された実際のランタイムに関するデータを探して、高いランプレートがどのように迅速な分析につながるかを現実的に把握してください。

温度の精度と均一性も反応を成功させるための鍵であり、すべてのサーマル サイクラーは PCR に必要な温度を生成するように設計されていますが、特定の機能により高い信頼性が得られます。これは、サンプルが限られ、信頼性の高い結果が得られるアプリケーションにとって重要です。臨床診断や法医学などで最も重要です。高分解能融解 (HRM) 分析などの高感度の技術に PCR 装置を使用する場合、正確な温度制御も重要です。蓋を加熱すると、PCR チューブ全体の温度均一性が向上します。これは、蓋​​を加熱しないとサンプルが蒸発し、温度が低いチューブの上部に凝縮する可能性があるためです。サーマルブロックの設計も温度制御に影響します。アルミニウム ブロックは最も経済的なオプションですが、導電性が最も低いため、導電性の高いブロックよりも温度均一性の達成が遅くなり、温度上昇率が低くなります。銀および金でコーティングされたブロックは高価ですが、熱伝達がより迅速に行われるため、ブロック全体に均一な温度分布が保証されます。

DNA ターゲットが異なれば、最良の増幅結果を得るために異なる温度が必要になる場合があります。たとえば、GC が豊富な配列の変性にはより高い温度が必要です。理想的なアニーリング温度はさまざまな要因にも影響されますが、このステップの温度は通常、プライマーの融解温度、プライマーペア間の融解温度の差、試薬濃度、pH、塩濃度の影響に基づいて選択されます。反応温度条件の最適化は複雑な作業になります。温度勾配機能を備えた PCR 装置は、1 回の実行で複数のアニーリング温度をテストできるようにすることで、PCR 法の最適化を支援するように設計されています。PCR 装置を使用して分析する予定のサンプルの種類と多様性によっては、時間を大幅に節約し、少ない実行で新しいプロトコールを最適化する試薬を得るために、グラジエント機能を備えた装置を選択することは追加コストの価値がある場合があります。

3. サーマルブロック

前述したように、PCR 機器で使用されるサーマル ブロックは温度制御に違いをもたらす可能性がありますが、ブロックの設計、およびさまざまなブロックに対応する機器の設計は、スループット、消耗品のコスト、および柔軟性にも影響します。一般的なブロックは 96 ウェルまたは 384 ウェル形式で提供されますが、48 ウェルや 1536 ウェルなどの他の形式も利用できます。ウェル数が多いほど、少ない反応量でより高いスループットが可能になり、最初はコストが高くなりますが、各ウェルで使用される試薬の量が減るため、最終的には反応あたりの価格が下がります。処理するサンプルの数とマシンの使用頻度を考慮すると、ウェル数の少ないサーマル ブロックとウェル数の多いサーマル ブロックのどちらが研究室にとって最も実用的でコスト効果が高いかが決まります。

一部の機器には固定ブロックフォーマットが付属していますが、その他の機器では交換可能なブロックを使用できるため、96 ウェルと 384 ウェルのフォーマット間、またはさまざまな用途に応じて異なるブロック材料間をより柔軟に切り替えることができます。一部のサーマルサイクラーは、同じ機器内に複数のブロックを収容できるため、異なるサンプルセットに対して異なるプロトコルを同時に実行できます。3「ユニバーサル」寸法のブロックにより、必要に応じて異なるサイズのチューブ、ストリップ、または PCR プレートを使用できる柔軟性がさらに高まります。 。

このコンポーネントは温度制御、サンプル処理、スループットにおいて重要な役割を果たしているため、サーマルサイクラーを選択する際にはサーマルブロックのオプションを慎重に検討する必要があります。サンプル量が少ない研究室や、日常的に少数のアッセイしか実行していない研究室の場合は、標準的な 96 ウェル形式の低コストの固定ブロック装置で十分な場合があります。ただし、モジュール式の柔軟な機器は、プロトコルの数が多く、サンプル量が変化し、独自のアッセイで同じ機器に依存するユーザーが増えている研究室や、将来的にスループット能力を拡張したいと考えている研究室にとっては有利である可能性があります。