現在の核酸抽出法

現在の核酸抽出法

パート1

核酸抽出 (NAE) は分子生物学において最も重要なステップの 1 つであり、この手順があらゆる分子診断キットの出発点となるため、生物学および医学の多くの分野で日常的に使用されています [1]。この重要な手順は 1 世紀以上前から知られており、ここ数十年で大幅に開発されました。ただし、NAE プロトコルが研究室の設定からポイントオブケア診断 (POC-Dx) の「現実の世界」に移行するには、まだある程度の進歩を達成する必要があります。

現在、細胞内核酸 (NA) は、ゲノム (または染色体)、プラスミド、およびさまざまな種類の RNA に大別されることが知られています。RNA はウラシルを持ち、DNA はチミンを持ちますが、核酸は同様の基本的な生化学的特性を示しますが、非常に異なる三次元構造 (ゲノム、プラスミド、tRNA、mRNA、rRNA など) を持つ可能性があります。ただし、構造の違いにもかかわらず、本書で説明する最も一般的に使用される方法は、RNA およびその多次元形式 (mRNA、rRNA、tRNA など) と同様に、多くの組織形式 (染色体、プラスミドなど) の DNA にも適用できます。 、miRNA など）に若干の変更を加えたものです。

NAE は大まかに 4 つのステップに分けることができ、サンプルと下流のアプリケーションに応じて調整できます。(i) 細胞破壊。(ii) 膜脂質、タンパク質、およびその他の核酸の除去、(iii) バルクからの核酸の精製/結合。(iv) 核酸濃度。

細胞の破壊または崩壊は物理的および/または化学的方法によって達成でき、その主な目的は細胞壁および/または細胞膜を破壊することです。破壊方法は主にサンプルの特性に基づいており、この目的のために、組織/細胞の破壊を達成するために幅広いツールやアプローチが単独または組み合わせて使用​​されます。溶解酵素、カオトロピック剤、およびさまざまな種類の界面活性剤が化学的溶解の主成分ですが、機械的方法では粉砕、せん断、ビーズの叩解、および衝撃によって細胞が破壊されます。興味深いのは、ある手法で良い結果が得られなかったとしても、別の手法で成功する可能性があるということです。浸透圧ショック法は、場合によっては、フェノールクロロホルム抽出やビーズ叩解などの一般的な NA 精製プロトコルよりも優れた結果をもたらします。細胞破壊は DNA 抽出にとって重要であるだけでなく、多くの組換えタンパク質や細胞のその他の重要な構成要素がこのプロセスを通じて回収できるため、バイオ医薬品産業においても重要な役割を果たします。細胞破壊のもう 1 つのアプローチは、さまざまな方法を組み合わせて使用​​することです。良い例は酵素溶解の場合で、多くのプロトコルではプロテアーゼを使用して NA をその保護タンパク質足場から解放します。また、タンパク質を含まない新しい NA を保護するために、溶液中に遊離する細胞ヌクレアーゼを不活化することが重要です。単一溶液中の界面活性剤とカオトロピック塩の組み合わせは、細胞壁や細胞膜を可溶化し、細胞内ヌクレアーゼを不活性化するために使用されます。一方、機械的破壊は力を利用して細胞の成分を抽出します。生物科学における粉砕の古典的な例は乳鉢と乳棒の使用ですが、現在では液体窒素の使用が最適化されています（サンプルで許可されている場合）。細胞壁は、超音波処理やキャビテーションによって引き起こされる圧力の急速な変化によって生じる衝撃波によっても破壊されることがあります。細胞破壊に利用できる他の機械的ツールには、接線力を使用して細胞に穴を開けるせん断や、前述したようにさまざまなガラスまたはスチールビーズを使用して強固な細胞壁を破壊するビーズビーティングがあります。.

NAE 法には DNA と RNA の両方の抽出が含まれますが、より広範に化学駆動法または固相法に特徴付けることができます。どちらにも上記の 4 つのステップが含まれています。次のセクションでは、生物学および医学で今日使用されている主な方法の動作原理および/または理論的根拠を確認します。分子診断は NAE から始まる技術に大きく依存しているため、POC-Dx で利用できるデバイスの基本機能のいくつかについても説明し、最後に NAE 法をポイントオブケア診断検査に適応させる際の課題と限界について説明します。